Usando etiquetas fluorescentes comutáveis, os engenheiros do MIT podem estudar como as moléculas nas células interagem para controlar o comportamento da célula. Os pesquisadores desenvolveram um método que pode observar até sete moléculas diferentes ao mesmo tempo, sendo até possível observar mais moléculas do que isso.
As células vivas são bombardeadas com uma variedade de sinais moleculares que influenciam o comportamento da célula. Ser capaz de medir estes sinais e como as células respondem a eles através de redes de sinalização molecular a jusante poderia ajudar os cientistas a aprender mais sobre como as células funcionam, incluindo o que acontece quando as células envelhecem ou ficam doentes.
Atualmente, tais estudos abrangentes não são possíveis porque as atuais técnicas de imagem celular estão limitadas à imagem de alguns tipos moleculares diferentes dentro das células simultaneamente. No entanto, os investigadores do MIT desenvolveram um método alternativo que pode observar até sete moléculas diferentes ao mesmo tempo, e potencialmente até mais do que isso.
Avanços na tecnologia de imagem molecular
"Na biologia, há muitos exemplos em que um evento desencadeia uma longa cadeia de eventos posteriores que levam a uma função celular específica", disse Edward Boyden, professor de neurotecnologia da Yihua Tan. "Como isso acontece? Esta é sem dúvida uma das questões fundamentais da biologia, então nos perguntamos: poderíamos simplesmente observar isso acontecer?"
O novo método utiliza moléculas fluorescentes verdes ou vermelhas que piscam em taxas diferentes. Ao criar imagens de células por segundos, minutos ou horas e, em seguida, usar algoritmos computacionais para extrair cada sinal fluorescente, a quantidade de cada proteína alvo pode ser rastreada ao longo do tempo.
Boyden, o autor sênior do estudo, também é professor de bioengenharia e de ciências cerebrais e cognitivas no MIT, investigador do Howard Hughes Medical Institute, membro do Instituto McGovern de Pesquisa do Cérebro do MIT e do Instituto Koch de Pesquisa Integrativa do Câncer, e co-diretor do Centro de Biônica K. Lisa Yang. Qian Yong, pós-doutorado no MIT, é o primeiro autor do artigo.
Avanços em Sinais de Fluorescência
Rotular moléculas dentro das células com proteínas fluorescentes permite aos pesquisadores aprender muito sobre as funções de muitas moléculas celulares. Esses estudos costumam usar proteína fluorescente verde (GFP), que foi usada pela primeira vez para imagens na década de 1990. Desde então, diversas proteínas fluorescentes que emitem luz em outras cores foram desenvolvidas para uso em experimentos.
No entanto, os microscópios ópticos típicos só conseguem resolver duas ou três destas cores, e os investigadores só conseguem vislumbrar a actividade global que ocorre dentro da célula. Se mais moléculas marcadoras pudessem ser rastreadas, os pesquisadores poderiam medir como as células cerebrais respondem a diferentes neurotransmissores durante a aprendizagem, ou estudar os sinais que levam as células cancerosas a metastatizar.
"Idealmente, você poderia observar as flutuações do sinal dentro da célula em tempo real e então entender a relação entre elas. Isso nos diria como a célula calcula", disse Boyden. "O problema é que você não pode olhar para muitas coisas ao mesmo tempo."
Em 2020, o laboratório de Boyden desenvolveu um método para gerar imagens simultâneas de até cinco moléculas diferentes dentro das células, direcionando repórteres luminescentes para diferentes locais dentro das células. Este método, chamado de “multiplexação espacial”, permite aos pesquisadores distinguir os sinais de diferentes moléculas, mesmo que emitam a mesma cor fluorescente.
No novo estudo, os investigadores adotaram uma abordagem diferente: em vez de distinguir os sinais com base na sua localização física, criaram sinais fluorescentes que variaram ao longo do tempo. Esta técnica depende de “fluoroforos comutáveis” – proteínas fluorescentes que podem ligar e desligar em taxas específicas. No estudo, Boyden e membros de sua equipe de pesquisa identificaram quatro fluoróforos verdes comutáveis e, em seguida, projetaram outros dois que ligam e desligam em taxas diferentes. Eles também identificaram duas proteínas fluorescentes vermelhas que ligam e desligam em taxas diferentes e projetaram um fluoróforo vermelho adicional.
Cada fluoróforo comutável pode ser usado para marcar diferentes tipos de moléculas dentro de células vivas, como enzimas, proteínas de sinalização ou partes do citoesqueleto. Depois de obter imagens das células durante minutos, horas ou até dias, os investigadores usaram um algoritmo computacional para captar sinais específicos de cada fluoróforo, semelhante à forma como o ouvido humano capta diferentes frequências de som.
“Em uma orquestra sinfônica, você tem instrumentos agudos, como flautas, e instrumentos graves, como tubas. No meio estão instrumentos como trombetas”, disse Boyden. "Todos eles têm sons diferentes e nossos ouvidos os classificam."
A técnica matemática que os pesquisadores usaram para analisar os sinais do fluoróforo é chamada de método linear de não mistura. Este método pode extrair diferentes sinais de fluoróforo, semelhante à forma como o ouvido humano usa um modelo matemático chamado transformada de Fourier para extrair diferentes tons em uma peça musical.
Assim que a análise for concluída, os pesquisadores podem ver quando e onde cada molécula marcada com fluorescência apareceu na célula durante todo o processo de imagem. A imagem em si pode ser realizada com um microscópio óptico simples e nenhum equipamento especializado é necessário.
Explore fenômenos biológicos
Neste estudo, os pesquisadores demonstraram seu método marcando seis moléculas diferentes em células de mamíferos que estão envolvidas no ciclo de divisão celular. Desta forma, eles foram capazes de determinar como os níveis de quinases dependentes de ciclina mudam durante o ciclo celular.
Os pesquisadores também descobriram que poderiam rotular outros tipos de quinases envolvidas em quase todos os aspectos da sinalização celular, bem como estruturas celulares e organelas, como o citoesqueleto e as mitocôndrias. Além de realizar experimentos utilizando células de mamíferos cultivadas em placas de laboratório, os pesquisadores também demonstraram que a técnica funciona no cérebro de larvas de peixe-zebra.
Os pesquisadores dizem que esta abordagem é útil para observar como as células respondem a qualquer entrada, como nutrientes, fatores do sistema imunológico, hormônios ou neurotransmissores. Também pode ser usado para estudar como as células respondem a mudanças na expressão genética ou a mutações genéticas. Todos esses fatores desempenham papéis importantes em fenômenos biológicos como crescimento, envelhecimento, câncer, neurodegeneração e formação de memória.
"Podemos pensar em todos estes fenómenos como representando um problema biológico geral, onde eventos de curto prazo - como a ingestão de um nutriente, aprender algo ou contrair uma infecção - produzem mudanças a longo prazo", disse Boyden.
Além de conduzir esses tipos de estudos, o laboratório de Boyden também está trabalhando para expandir a gama de fluoróforos comutáveis para estudar mais sinais dentro das células. Eles também esperam adaptar o sistema para que possa ser usado em modelos de mouse.