Os cientistas estudaram detalhadamente a estrutura tridimensional de um dos menores sistemas CRISPR-Cas13 conhecidos, o CRISPR-Cas13bt3, que é usado para modificação de RNA e opera de forma diferente de outras proteínas da mesma família. Esta descoberta permite-lhes melhorar a precisão da ferramenta, permitindo um melhor acesso e entrega ao site de edição alvo, permitindo-lhes potencialmente combater os vírus de forma mais eficaz, visando o RNA.
Cientistas da Rice University detalharam a estrutura tridimensional de um dos menores sistemas CRISPR-Cas13 conhecidos para cortar ou modificar RNA e usaram suas descobertas para modificar ainda mais a ferramenta para melhorar sua precisão. Segundo estudo publicado na Nature Communications, a molécula funciona de maneira diferente de outras proteínas da mesma família.
“Existem diferentes tipos de sistemas CRISPR, e o foco do nosso estudo desta vez é aquele chamado CRISPR-Cas13bt3”, disse Yang Gao, professor assistente de ciências biológicas e pesquisador do Instituto de Prevenção e Pesquisa do Câncer do Texas, que ajudou a liderar o estudo. "O que é único nisso é que é muito pequeno. Normalmente, moléculas como esta contêm cerca de 1.200 aminoácidos, e esta tem apenas cerca de 700, então isso já é uma vantagem."
O tamanho pequeno é uma vantagem, pois permite melhor acesso e entrega ao site de edição alvo. Ao contrário dos sistemas CRISPR associados à proteína Cas9, que normalmente tem como alvo o DNA, os sistemas relacionados ao Cas13 têm como alvo o RNA, que são as "instruções" intermediárias para converter a informação genética codificada no DNA em um modelo para montar uma proteína.
Os investigadores esperam que estes sistemas de direcionamento de ARN possam ser usados para combater vírus, que normalmente utilizam ARN em vez de ADN para codificar a sua informação genética.
“Meu laboratório é um laboratório de biologia estrutural”, disse Gao Yang. "Estamos tentando entender como esse sistema funciona. Portanto, parte do nosso objetivo é poder vê-lo em três dimensões e criar um modelo que nos ajude a explicar seus mecanismos."
Os pesquisadores usaram microscopia crioeletrônica para mapear a estrutura do sistema CRISPR, colocando a molécula sobre uma fina camada de gelo e disparando um feixe de elétrons através dela, gerando dados que foram então processados em um modelo tridimensional detalhado. Os resultados os surpreenderam.
"Descobrimos que este sistema implanta um mecanismo diferente de outras proteínas da família Cas13, que possuem dois domínios que inicialmente se separam, e depois que o sistema é ativado, eles se unem - um pouco como os dois braços de uma tesoura - e fazem o corte. Este sistema é completamente diferente: a tesoura já existe, mas precisa prender a fita de RNA no local alvo certo. Para fazer isso, ele usa um elemento de ligação nessas duas alças exclusivas para conectar diferentes partes da proteína. "
Xiangyu Deng, associado de pós-doutorado no laboratório de Gao Yang, disse: "Determinar a estrutura do complexo de proteína e RNA é realmente desafiador, e temos que solucionar muitos problemas para tornar o complexo de proteína e RNA mais estável para que possamos mapear sua estrutura. "
Depois que a equipe descobriu como o sistema funcionava, os pesquisadores do laboratório da engenheira química e biomolecular Shirley Gao começaram a ajustar o sistema para melhorar sua precisão, testando sua atividade e especificidade em células vivas.
"Descobrimos que esses sistemas foram capazes de atingir o alvo mais facilmente durante a cultura celular", disse Sherry Gao, professor assistente de engenharia química e biomolecular do Ted N. Law. "O que é realmente valioso neste trabalho é que os insights detalhados da biologia estrutural nos permitiram identificar racionalmente os esforços de engenharia necessários para melhorar a especificidade da ferramenta, mantendo ao mesmo tempo uma alta atividade de edição de RNA alvo."
Emmanuel Osikpa, assistente de pesquisa no laboratório de Xue Gao, conduziu experimentos com células e confirmou que o Cas13bt3 projetado pode atingir grupos de RNA específicos com alta fidelidade.
“Consegui mostrar que este Cas13bt3 projetado teve um desempenho melhor do que o sistema original”, disse Osikpa. "O estudo abrangente da estrutura destacou as vantagens de uma abordagem direcionada e orientada pela estrutura em relação às telas de mutagênese aleatória dispendiosas e em larga escala."